Bezárás
Tudománykövető

A crisper súlyos bukása – Mégsem pontos!

(Tudománykövető No38)

Az alább olvashatók nem tartoznak a könnyen emészthető hírek közé, bár mindent megteszek, hogy felülnézetből, a legegyszerűbb formában mondjam azokat el. Kétségtelen, hogy a nehezen kommunikálható géntechnológiai hírek olyan országokban, mint hazánk, ahol nincs magas szintű ismeretterjesztés (elkerülhetetlen lenne az Élet és Tudomány és a Természet Világa megújítása és ebbéli vezető szerepük a napi sajtó ún. tudományos rovataival szemben) nagyon nehéz helyzet elé állítja azt, aki erről érthetően szeretne írni. Az olvasók, de sajnos a vállalkozó szemléletű újságírók ismereti alapjai is hiányosak. A géntechnológia európai sorsa rendkívül fontos a természettudományon belül. Segítségével valóban új távlatok nyílhatnak az emberiség számára, de úgy tűnik, hogy még nem most. A genomszerkesztés módszerei közül a crisper súlyos botladozását mindenkinek a figyelmébe ajánlom, de legfőként a Magyar Tudományos Akadémia (MTA) éppen leköszönő elnökségének, amely Lovász László alatt az elővigyázatosság és kiegyensúlyozottság elvéről ebben a tekintetben megfeledkezett, és sajnos nem védhető módon konfrontálódott a mezőgazdasági tárcával, valamint a politikai pártok többségével. Lehet persze ilyesmit tenni, csak ekkor hosszú távon ezt indokolni is tudni kell. Én Heszky László óta nem látok olyan hiteles személyt nálunk, aki kellő rálátással és elfogultság nélkül kialakított, mezőgazdasági géntechnológiát támogató álláspontját meggyőzően tudta volna kommunikálni.

A hír, ami nem először röppen fel, és bizonyára nem is utoljára, a génszerkesztés egyik nagyreményű módszerének (CRISPR/Cas9crisper) bukdácsolását követő eltaknyolásáról szól a génterápia területén. Bocsánat, hogy nem szépítem a dolgot, hiszen 2017-ben egy elhamarkodott állásfoglalást hazánkban az MTA elnöksége az asztalra tett Dudits Dénes (48. kép), Kosztolányi György és Venetianer Pál géntechnológiai véleményvezérek előterjesztésére, ami a civilszervezeti jellegű Európai Akadémiák Tudományos Tanácsadó Testülete (EASAC) véleményére támaszkodott. Az MTA elnökségének egybehangzó véleményében számtalan a kérdésben kellően mély ismeretekkel nem rendelkező tudós vett részt, hiszen a genetika nem a szorosan vett szakterületük. Egészségügyi és mezőgazdasági géntechnológiát illetően valamelyik területen Freund Tamás (jelenlegi elnökjelölt), Barnabás Beáta, Kosztolányi György, Fésüs László és Tulassay Tivadar; míg a tanácskozási jogú tagok közül Falus András és Nagy Ferenc ismeretei elégségesek a megalapozott döntéshez. 24 elnökségi tagból tehát öt szakértő, ami 21%, vagyis minősített kisebbség. Meglep, hogy a mezőgazdasági osztály nevében Németh Tamás talajtani szakember igennel szavazott, ami aligha reprezentálja a hazai véleményeket. Döbbenetes, hogy az elnökségi szavazás során azok a mellékhatásokkal foglalkozó tudományok, mint az ökológia (benne környezetanalitika és ökotoxikológia) és dietétika szóhoz sem jutottak, vagyis nem voltak ebbéli szakértők az előterjesztők között. Súlyos hibának gondolom ezt az MTA állásfoglalások gyakorlatában, bár hozzátehetem a nemzetközi megítélésnek nem ez a mértékadó szintje. Az indokaim az alábbiakban olvashatják.

A pro-GMO lobbisták (nálunk a Dudits Dénes által vezette nem közhasznú civilszervezetnek minősülő BZBE → IMBE) hibátlannak állították be a genomszerkesztési módszereket, és az európai politika nagyszínpadán komoly lobbizásba kezdtek azért, hogy az új európai politikai vezetés az ezekkel a módszerekkel végrehajtott örökítőanyag-módosításokat vegye ki az Európai Unió GMO-szabályozása alól. Én a független kutatókat tömörítő European Network of Scientists for Social and Environmental Responsibility (ENSSER) álláspontjával értettem egyet, ami az elővigyázatosság elve alapján értékelte a technikát, de nem próbált olyan színben feltűnni mintha a Tudomány letéteményese lenne.

A hazai agrárpolitika rezonált az MTA elnökségének elhamarkodott, szakmailag kétes értékű lépésére, és a miniszterváltáskor Dudits Dénes géntechnológus hajdani egyetemi oktatótársa Nagy István méhész a parlamenti bizottsági meghallgatásakor a Mezőgazdasági Bizottság előtt félreérthetetlenné tette, hogy készen áll a géntechnológia melletti stratégiai váltásra. Hasonló értelemben nyilvánult meg a Nemzeti Agrárgazdasági Kamara elnöke, a közgazdász Győrffy Balázs (Gyuricza Csaba talajtani szakértő támogatta ebben), aki hirtelen a genomszerkesztésben látta meg a mezőgazdaságunk jövőjét. Milyen felelős tudásra támaszkodott vajon mindez?

Az idő telt-múlt, míg végül 2018. július 25-én az Európai Unió Bírósága (Curia) állást foglalt, s ezt a 111/18. sz. sajtóközleményében hozta nyilvánosságra. Az állásfoglalás semmiféle enyhítést nem tartalmazott a genomszerkesztésre nézve. Nagy miniszter azonnal hátraarcot vett. Később a minisztériumban való szakértői megbeszélésen közel száz szakember előtt kötelezte el magát hazánk GMO-mentessége mellett, ami ebben az értelemben tévedés. Korszerű gyógyszereink többsége rekombináns termék, és hazánk hétszázezer tonna körüli mennyiségű GM-szóját szállít be az országba évente. Gyuricza Csaba (NAIK) most ennek kiváltását ígérte jelentős K+F+I támogatás fejében. Szóval nem GMO-mentes ország vagyunk, hanem GMO-termesztéstől mentes ország, ami nagy különbség.

48.kép: Dudits Dénes 2017-es előadása az MTA épületében (Fotó: Szigeti Tamás/MTA)

Min alapult Dudits és társainak előterjesztése? Nos, szerintük – ez a GMO-lobbiszervezeteknél közös érvelési stratégia – arra, hogy ha nem kerül be új gén az élőszervezetbe, akkor az minősüljön mutációs hatásnak (és ne géntechnológiai módosításnak), amint az korábban más módszerekkel (besugárzás, kémiai eredetű mutagének) használatos és külön engedélyezési procedúra nélkül elfogadható volt. Ilyen módon kerüljenek ki a genomszerkesztett változatok az uniós géntörvény hatálya alól. Ezt az Egyesült Államokban a Food and Drug Administration (FDA) már megvalósította, s a jövő élelmiszer-kereskedelmében ennek ma még be sem látható inkompatibilitási következményei lesznek. A FDA véleménye egyébként nem genomszerkesztési módszerekre fókuszál, hiszen köztudott, hogy a ZFN, TALEN és crisper módszerekkel transzgenikus szervezetek is előállíthatók, amelyek egyértelműen GMO minősítésűek. A géncsendesítést emelte ki, ahol valamilyen meglévő gént rontunk el, ami által a módosított szervezet viselkedése megváltozik. Nem mondanám, hogy nincs ez rendjén, ha a burgonyát illetően nem az ezen dolgozó egyik legismertebb ipari kutató, Caius Rommens az Innate burgonyák sikeres korai fejlesztője nem hívta volna fel ennek árnyoldalaira a figyelmet. Pandora’s Potatoes: The Worst GMOs című könyvében közkinccsé tette, hogy egy enzim kódjának elrontása fehérré teszi ugyan a gyorsan feketedő burgonyát, de az addig tartó biokémiai folyamatokat nem akadályozza, vagyis a beltartalom módosul, csak az nem válik elszíneződés útján láthatóvá; speciális ellenőrzés ekkor is kell.

A crisper sikerét nem a kiemelkedő pontossága idézte elő, hanem az, hogy a sok innovátor miatt (százas nagyságrendről beszélnek Emmanuelle Charpentier és Jennifer Doudna, valamint Feng Zhang után) nem tudott senki sem megkülönböztetett erejű alapszabadalmat szerezni az eljárásra. A ZFN és TALEN ezzel szemben iparjogvédelmet élvez, vagyis, ha ezeket a pontosabb eljárásokat használja fel valaki, akkor szabadalmi díjat kell fizetni a módszerszabadalom tulajdonosának. A TALEN módszer tulajdonosai például gyakorlatilag mindenkinek, aki kéri, megadják a jogot a módszer használatához, nem is magas szabadalmi díj fejében, és a mérsékelt, de hatalmas számú alkalmazásból befolyó royalty révén kaszálnak. A crisper esetében a jogi helyzet olyan kusza, hogy az már a fejlesztés korlátozó tényezője lehet – amennyiben a szabadalmi díjra jogosultak utólag érvényt próbálnának vagy tudnának szerezni a jogaiknak. Nem véletlen, hogy a gazdasági fejlődés iránt elkötelezett OECD 2019-ben egyenesen tematikus konferenciát szervezett a crisper szellemi jogvédelmének kérdéséről. A crisper módszeréről az első pillanattól kezdve tudjuk, hogy olcsó, gyors, de sajnos pontatlan. Fejlesztői azonban úgy gondolkoztak róla, hogy a további fejlesztések megoldják a hiányosságait.

38.1.ábra: A crisper felismerés közben (korálzöld – donor-DNS, átalakítandó örökítőanyag; narancsvörös – sgRNS, egyszálas módosításvezető; csillag – a vágás helye) (forrás)

A crisper működésének megértéséhez javaslom a Nature által szerkesztett négy és félperces videó megtekintését. A 38.1. ábrán a felismerés és vágás pozícióját látjuk, ami után következik a tényleges átalakítás. Mindehhez a sejt DNS-javító funkcióit használják fel, amely alapvetően kétféle lehet: homológiaalapú javítás (homology directed repair, HDR) vagy nem homológ végillesztés (non-homologous end joining, NHEJ). Mindezt nem részletezem, mert nem szeretném növelni azok számát, akiket elveszítek olvasás közben. Tény, hogy ha a crisper-konstrukció új örökítő anyagot juttat be a genomba, akkor a homológiaalapú javítást használja. Nos, a bizonytalanságok számbavétele nem érdemtelen. A felismerő szakasz hosszát optimalizálják: ha túl rövid, akkor túl sok célhelyet vél felismerni, ha viszont hosszú, akkor a felismerés folyamatában képződhetnek rajta hurkok, és a középső rész kieshet az azonosítás folyamatából. Az optimalizált rész is téveszthet, vagyis a genomban felismerni vélhet olyan részeket, amelyek valójában nem teljesen azonosak a célzottal, csak hasonlatosak. A vágás pontos helye is rejt hibaforrást, hiszen vághat a kívánt hely előtt vagy mögött, aminek végeredménye nem az lesz, amit vártunk, vagyis kereteltolódási mutációk jöhetnek létre. Az átírás ugyanis három egységet érintően folyamatos, s egy hiányzó vagy fölöslegben lévő egység az inkriminált helytől teljesen más fehérjét eredményez.

Ha a crisper biokémiai megvalósító egységeit szemrevételezzük, azt látjuk, hogy igen nagy fehérjemolekulákról van szó. Hogyan jutnak ezek be a sejt belsejébe? Az állat-biotechnológiában használatos injektálásnál ez tiszta sor, mert mi visszük be a sejtmagba szúrt kapillárissal (címkép). Növények, de a génterápiák esetében is más a helyzet, ahol valamilyen a sejt- és sejtmaghártyán áthatoló módszerre/vektorra van szükség. A crisper esetében itt két pro-GMO szemléletű csúsztatásra is fény derült. A crisper alkotó elemei nem eukarióta (sejtmaghártyás élőlények) génekből állnak, vagyis nem fedi a valóságot az az állítás, hogy a sejtbe nem került be fajidegen örökítőanyag. Bekerül, de ez a prokarióta-eredetű örökítőanyag – tudomásunk szerint – nem épül be a célsejt genomjába. Nem fedi a valóságot, hogy ez a bevitel szuperpontos, hiszen két beviteltől is szó van. Az egyik a CRISPR/Cas9 genetikai elemeit tartalmazó plazmid bejuttatása (három stratégia is adott, de a bevitelük itt sem nem célzott, s nem is pontos, lásd 38.2. ábra), míg a másik bevitel a sejt rutinja által segített minirobot ügyködése az örökítőanyagon. Ez az, ami felismer – vág – kiegészít (ahogy tervezték), de sajnos a maga módján és a sejt automatikus DNS-javító mechanizmusai által befolyásoltan. A korábbi tévesztési lehetőségek tehát kiegészülnek a plazmidbevitel pontatlanságaival és a kevéssé ismert DNS-javító mechanizmusok működésével, amiről hallgatnak a lelkendező híradások.

38.2.ábra: A CRISPR/Cas9-plazmiddal történő bejuttatásával kapcsolatos alapvető stratégiák (Grafika: Liu et al., 217)

Eljutottunk oda, hogy van valamilyen átalakításért felelős konstrukciónk, és azt bejuttattuk a sejtbe/sejtmagba. Az állat-géntechnológiában itt újabb hibalehetőség adódik. Zigótával dolgozunk, de azt osztódást megelőzően módosítani korántsem egyszerű (címkép), hiszen az embrió sejtjei a megtermékenyülés után gyors osztódásba kezdenek. Ez súlyos probléma, mert a keletkező utódsejtekben (2-8-sejtes állapot) azonos változtatásra lenne szükséges ahhoz, hogy ne eltérő sejtvonalakból álló mozaikutód (kiméra) jöjjön létre (38.3. ábra).

He Jiankui csoportjának embert érintő crisper-használata ezen az úton eredményezett kimérákat és nem tervezett változásokat. Ez volt az a pont, ahol a módszer legismertebb innovátora Jennifer Doudna is annak a véleményének adott hangot, hogy ez a módszer genomjavítási feladatra még nem eléggé pontos. He Jiankui és csoportjának felelős tagjai komoly börtön- és pénzbüntetéssel sújtották. A géntechnológusok világszerte nem tiltakoztak a kínai bíróság ítélete ellen.

Milyen felkészültséggel, előélettel és tudással győzték meg tehát a hazai potentátok az MTA elnökségét, és hogyan jutottunk oda, hogy az ezt az előterjesztést ellenszavazat nélkül elfogadta? Tévedhet a hazai tudományos életet vezető szervezet ennél nagyobbat? Nem hiszem. A tényeket ignoráló vezetői magatartás súlyos hiba, aminek nem lett volna szabad bekövetkeznie. Nemcsak az emberi genom módosítása nem játékszer, kedves kollégáim, hanem a háziállataink és haszonnövényeink piszkálása sem azzal a genetikai tudással, ami rendre kevéskének bizonyul a leegyszerűsítő alkalmazástechnikai szemlélet miatt, amivel én is sokszor találkoztam. Nem biztos, hogy meg is kell tennünk azt, amit technikailag meg tudunk már csinálni! Tisztában vagyok a szigorúságommal, de nekem és hajdani kollégáimnak irdatlan mennyiségű rossz pillanatot tetszettek azzal szerezni, hogy az MTA nem támogatta, sőt ignorálta az ebbéli munkánkat, és sajnos azt kell mondanom, hogy a mezőgazdasági tárca sem volt különb, amely úgy gondolta, hogy a mezőgazdasági géntechnológia politikai ügy, amit a géntörvényben és az Alaptörvényben örökre lerendezett, illetve már jogászok és politikusok kellenek csak a szabályzáshoz. Sőt mára a hazai média is elunta, hogy nem ért sokat az egészből, így kurrens, bár kiegyensúlyozatlan híreket fordítgat. Ha valamit akadémikusok állítanak, akkor az a számukra igaz lehet, pedig valójában ebben sem az előítéleteink, hanem a megmért valóság dönt. A tudomány nem a többség uralmáról szól.

38.3.ábra: 4-sejtes állapotú zigóta módosítása (Fotó: Getty Images/iStockphoto)

Ennyi előzmény után jutottunk közelebb ahhoz, amiről itt írni szeretnék. Azoknak a tudományos cikkeknek a sorsáról szólok, amelyeknek célja még csak nem is a környezeti és egészségügyi mellékhatások vizslatása volt, hanem genetikai/biokémiai vizsgálatok alapján a genomszerkesztési módszer megbízhatóságának és pontosságának értékelésére irányultak. A teljesség igénye nélkül 2013-ban Fu és munkatársai a Nature Biotechnology (Nature Publishing Group) szaklapban ismertetett, emberi sejtvonalon crisper-rel végzett munkájukban jelentős számú céltévesztő hatásról számoltak be. 2015-ben Liang és munkatársainak a Protein & Cell (Springer Science+Business Media) folyóiratban megjelent cikkük tanulsága szerint crisper módszerrel igyekeztek korrigálni egy hibás gént. 86 triploid embrióba injektáltak génkonstrukciót. Azt találták, hogy a bevitt konstrukció sokféle és meglepő, nem célzott genetikai problémát okozott. Kétségtelen, hogy a triploid zigóta genetikai viselkedése kaotikus.

2017-ben Schaefert és munkatársai a Nature Methods-ban (Nature Publishing Group) a crisper pontatlanságait sorolták. A cikkel kapcsolatban Stephen Tsang nyilatkozatai váltottak ki komoly viharokat, amelyek szerint az általuk kifejlesztett módszerrel több mint ezer nem tervezett mutációt mutattak ki a crisper használata után. A céljuk egyetlen nukleotid kicserélése volt. A kezelés gyógyította ugyan a génhiba miatti vakságot, azonban 1.500 körüli pontmutációt és száz körüli nagyobb változtatást (inzerció/deléció) okozott. 2018-ban ezt a cikket visszavonták, s a vita során az University of Iowa, az University of Columbia és az University of Stanford intézeteiben dolgozó szerzőket lazán ócsárolták a crisper üzletében érdekeltek. „Egyértelmű, hogy a szerzők nem szakértők a CRISPR/Cas9 módszerében, a teljes genom szekvenciájában, de a genetika alapvetéseiben sem. Állításuk a »váratlan mutációkról« egyértelműen bizonyítják a témára vonatkozó éleslátásuk hiányát.” – jelentette ki az Intellia Therapeutics Inc. csapata. Az amerikai egyetemek ipari kioktatása tehát folyamatban van.

2018-ban Aryal és mtsai a Cell Death & Disease (Springer Nature) szaklapban arról adtak hírt, hogy egér- és humán-sejtvonalakkal, valamint 38 egérembriókkal dolgozva igen gyakori hibákat találtak a crisper módszerével végzett genomszerkesztés során, ami a módszer humán-génterápiára való alkalmazását kérdőjelezi meg. Ehhez pontosan illeszkedik He Jiankui és munkatársai büntetésének indoklása.

Inna E. Pristyazhnyuk és Oleg L. Serov az Orosz Tudományos Akadémia (Tomsk) és a Novoszibirszki Egyetem munkatársai 2019-ben már Boris V. Skryabin ez évi cikkével nagyon is egymást erősítő közlemény tett nyilvánossá a Scientific Reports (Nature Publishing Group) szaklapban. Arról írtak, hogy egérrel dolgozva a crisper megabázis nagyságú nem tervezett örökítőanyag-vesztést és -duplikációt képes okozni a genomban. Skryabin és munkatársai még újabb, a Science Advances (American Association for the Advancement of Science) folyóiratban éppen megjelent cikke szintén pontosan beleillik abba a sorba, amit eddig felsoroltam. Nem gondolom, hogy a szerzőknek könnyű lehetett ezt a cikküket eljuttatni a megjelenésig: 2019. március 11-én küldték meg a lapnak a kéziratukat, de a szerkesztőség csak nyolc hónap múltán, november 25-én fogadta azt el közlésre. Megjelenésének dátuma 2020. február 12. A szerzők megtermékenyített egérpetesejt módosítását hajtották végre, és a beépülések helyeit vizsgálva megdöbbentő eredményekre jutottak. 193 módosított embrióból 34 kölyök született, ami az eljárást nem mutatja hatékonynak. Ezek közül összesen csak két esetben találtak korrekt DNS-cserét! Ez elképesztően alacsony találati arány. Lehet erre azt mondani, hogy pontos módszer? A többi genomszerkesztett állatban különféle zavarokat állapítottak meg a módosítást illetően (38.4. ábra). Vizsgálták a kérdéses DNS-részek állapotát az utódgenerációban is, amit vad típusú törzzsel állítottak elő. Az utódok 57%-a több módosított kópiával rendelkezett, amit a hagyományos PCR-vizsgálat csak 17%-nak mért.

A cikk ismeretterjesztő változata szinte azonnal megjelent, amelyben a szerzők is fókuszáltak némely állításukra a helyenként elég homályosnak tűnő eredeti cikkben. Ez a megjegyzésem a szétágazó módszerű vizsgálatokat összegző ábra hiányára vonatkozik. Az eredményeket magyarázó Katharina Boroviak (Sanger Insitute) arról beszélt, hogy az ő laborjuk is érzékelte a bevitt DNS-szekvenciák duplikációját crisper használatakor. Azt is igazolta, hogy a PCR ezeket az ismétlődéseket nem mutatja ki kellő érzékenységgel. Véleménye szerint mindenki arról beszél, hogy a crisper használata milyen egyszerű és olcsó, de a vele dolgozók tudják, hogy a hibázás gyakoribb, mint a kívülállók gondolnák. Ed Bolt (University of Notthingham) szerint a sejtek DNS-javítási mechanizmusa nem kellően ismert, bár a végső állapot előállításában kulcsszerepet játszik. A Cas9 aktiválja ezt a nagyon bonyolult mechanizmust. A következményekről csak feltételezéseink vannak. Mindezt nem környezetvédelmi civilszervezetek állítják, hanem molekuláris biológusok a világ vezető tudományos lapjaiban.

38.4.ábra: A donor DNS különféle integrációs zavara és duplikálódása (Forrás: Skryabin et al., 2020)

Bár ez utóbbi cikk első és utolsó levelező szerzői orosz származásúak (Boris V. Skryabin és Timofey S. Rozhdestvensky), a munka a Westfälische Wilhelms-Universität Münster több intézetének képviseletében olvasható egy közel 13-as impaktfaktorral rendelkező újságban. Nincs azzal kapcsolatos reményem, hogy a környezetvédelmi civilszervezetek és az üzletben érdekeltek nem próbálják majd felhasználni/ízekre szedni ezt a cikket is. A módszer köré mára speciális tudományos ipar épült ki, amely sgRNS-eket és plazmidokat gyárt/gyűjt, továbbá génkönyvtárat épít (Addgene), és minden szempontból kiszolgálja az ezt a technológiát használni szándékozókat. A módszer három vezető egészségügyi cége (CRISPR Therapeutics, Editas Medicine, Intellia Therapeutics) a tőzsdén is megjelent; összértékük egymilliárd US$ körüli. A tudomány területén való viselkedésük a nemzetközi cégek agresszivitásával vetekedik.

2017-ben az oroszokat tartották a géntechnológiával kapcsolatos rémhírek legfőbb forrásának. Én azért úgy gondolom, hogy nemzetközileg respektált tudományos lapokban megjelenve az a megállapítás, hogy a crisper pontatlan és jelenleg érthetetlen mechanizmus alapján okozza a bevitt gén nem várt multiplikációját, ami hagyományos PCR módszerrel ki sem mutatható nagyon súlyos vádak ahhoz, hogy az Európai Unió komolyan megfontolja, hogy félredobja az elővigyázatosság elvét a genomszerkesztés területén. Ugyanakkor az európai géntörvények genetikai alapú szigorú felülvizsgálata elkerülhetetlen, hiszen tisztáznia kell a jogi viszonyunkat azokkal a termékekkel, amelyeket új technológiákkal állítanak elő és az Egyesült Államok közülük párat már ki is eresztett az engedélyezési felügyelete alól, ami eddig sem alkalmazott követésre alkalmas jelölést.

Darvas Béla

Előfizetőket keresünk – támogasd az Átlátszót

Az Átlátszó nonprofit szervezet, nem fogadunk el pénzt politikai pártoktól vagy az államtól. Rád viszont nagyon számítunk!

Támogatom